تلعب طرق البحث البيولوجي الجزيئي دورًا كبيرًا في الطب الحديث والطب الشرعي وعلم الأحياء. بفضل التقدم في دراسة الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، يستطيع الشخص دراسة جينوم الكائن الحي ، وتحديد العامل المسبب للمرض ، والتعرف على الحمض النووي المطلوب في خليط من الأحماض ، وما إلى ذلك.
طرق البحث البيولوجي الجزيئي. ما هذا؟
في السبعينيات والثمانينيات ، نجح العلماء لأول مرة في فك رموز الجينوم البشري. أعطى هذا الحدث دفعة لتطوير الهندسة الوراثية والبيولوجيا الجزيئية. أدت دراسة خصائص DNA و RNA إلى حقيقة أنه من الممكن الآن استخدام هذه الأحماض النووية من أجل تشخيص المرض ، ودراسة الجينات.
الحصول على DNA و RNA
تتطلب طرق التشخيص البيولوجي الجزيئي وجود مادة البداية: غالبًا ما تكون عبارة عن أحماض نووية. هناك عدة طرق لعزل هذه المواد من خلايا الكائنات الحية. كل واحد منهم له مزاياه وعيوبه ، وهذا ضرورييؤخذ في الاعتبار عند اختيار طريقة لعزل الأحماض النووية النقية.
1. الحصول على DNA طبقًا لمرمور. تتمثل الطريقة في معالجة خليط من المواد بالكحول ، ونتيجة لذلك يترسب الحمض النووي النقي. عيب هذه الطريقة هو استخدام المواد العدوانية: الفينول والكلوروفورم.
2. عزل الحمض النووي وفقًا لبوم. المادة الرئيسية المستخدمة هنا هي غوانيدين ثيوسيانات (GuSCN). يساهم في ترسيب حمض الديوكسي ريبونوكلييك على ركائز متخصصة ، والتي يمكن بعد ذلك جمعها باستخدام مخزن مؤقت خاص. ومع ذلك ، فإن GuSCN هو مثبط لـ PTC ، وحتى جزء صغير منه يدخل في الحمض النووي المترسب يمكن أن يؤثر على مسار تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والذي يلعب دورًا مهمًا في العمل مع الأحماض النووية.
3. ترسيب الشوائب. تختلف الطريقة عن الطرق السابقة في أنها ليست جزيئات حمض الديوكسي ريبونوكلييك المترسبة ، بل الشوائب. للقيام بذلك ، يتم استخدام المبادلات الأيونية. العيب هو أنه ليس كل المواد يمكن أن تترسب.
4. الفحص الشامل. تُستخدم هذه الطريقة في الحالات التي لا تكون فيها المعلومات الدقيقة حول تكوين جزيء الحمض النووي ضرورية ، ولكن من الضروري الحصول على بعض البيانات الإحصائية. ويفسر ذلك حقيقة أن بنية الحمض النووي يمكن أن تتلف عند معالجتها بالمنظفات ، وخاصة القلويات.
تصنيف طرق البحث
جميع طرق البحث البيولوجي الجزيئي مقسمة إلى ثلاث مجموعات كبيرة:
1. التضخيم (باستخدام العديد من الإنزيمات). هنايشير إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل - تفاعل البلمرة المتسلسل ، والذي يلعب دورًا كبيرًا في العديد من طرق التشخيص.
2. عدم تضخيم. ترتبط مجموعة الطرق هذه ارتباطًا مباشرًا بتشغيل مخاليط الأحماض النووية. الأمثلة هي 3 لطخات ، تهجين في الموقع ، إلخ.
3. تعتمد الطرق على التعرف على إشارة من جزيء مسبار يرتبط بمسبار معين DNA أو RNA. مثال على ذلك هو نظام التقاط Hybride (hc2).
الإنزيمات التي يمكن استخدامها في طرق البحث في البيولوجيا الجزيئية
تتضمن العديد من طرق التشخيص الجزيئي استخدام مجموعة واسعة من الإنزيمات. فيما يلي الأكثر استخدامًا:
1. إنزيم التقييد - "يقطع" جزيء الحمض النووي إلى الأجزاء الضرورية.
2. بوليميراز الحمض النووي - يصنع جزيء مزدوج تقطعت به السبل من حمض الديوكسي ريبونوكلييك.
3. النسخ العكسي (التراجع) - يستخدم لتوليف الحمض النووي على قالب الحمض النووي الريبي.
4. DNA ligase - المسئول عن تكوين روابط الفسفوديستر بين النيوكليوتيدات.
5. نوكلياز خارجي - يزيل النيوكليوتيدات من الأقسام الطرفية لجزيء الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين.
PCR هي الطريقة الرئيسية لتضخيم الحمض النووي
يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بنشاط في البيولوجيا الجزيئية الحديثة. هذه طريقة يمكن من خلالها الحصول على عدد كبير من النسخ من جزيء DNA واحد (يتم تضخيم الجزيئات).
الوظائف الرئيسية لـ PCR:
- التشخيصالأمراض ؛
- استنساخ شرائح الحمض النووي والجينات.
العناصر التالية مطلوبة لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل: جزيء DNA الأولي ، بوليميراز DNA القابل للحرارة (Taq أو Pfu) ، فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد (مصادر القواعد النيتروجينية) ، الاشعال (2 بادئات لكل 1 جزيء DNA) ونظام التخزين المؤقت نفسه ، حيث تكون جميع التفاعلات ممكنة.
يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل من ثلاث خطوات: التمسخ ، التلدين التمهيدي والاستطالة.
1. تمسخ. عند درجة حرارة 94-95 درجة مئوية ، تنكسر الروابط الهيدروجينية بين شريطين من الحمض النووي ، ونتيجة لذلك نحصل على جزيئين أحاديي السلسلة.
2. التلدين التمهيدي. عند درجة حرارة 50-60 درجة مئوية ، يتم توصيل البادئات بنهايات جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة بنوع التكامل.
3. استطالة. عند درجة حرارة 72 درجة ، يحدث تخليق جزيئات ابنة مزدوجة الشريطة من حمض الديوكسي ريبونوكلييك.
تسلسل الحمض النووي
غالبًا ما تتطلب طرق البحث البيولوجي الجزيئي معرفة تسلسل النوكليوتيدات في جزيء الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين. يتم إجراء التسلسل لتحديد الشفرة الجينية. سوف يعتمد التشخيص الجزيئي للمستقبل على المعرفة المكتسبة من التسلسل البشري.
يتم تمييز الأنواع التالية من التسلسل:
- تسلسل ماكسام جيلبرت ؛
- تسلسل سانجر ؛
- التسلسل الحراري ؛
- نانوبورالتسلسل.
