صبغة جرام تستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة لأنها واحدة من أسهل الطرق للتمييز بين البكتيريا بناءً على تكوين جدار الخلية. وفقًا لجرام ، يمكن تقسيم جميع البكتيريا إلى موجبة الجرام (جرام (+)) وسالبة الجرام (جرام (-)). تم تطوير طريقة صبغ غرام في عام 1884 ولم تفقد شعبيتها منذ ذلك الحين ، على الرغم من تعديلها عدة مرات.
هيكل جدار الخلية
تلطيخ الجرام يكشف ما إذا كانت البكتيريا موجبة الجرام أو سلبية الجرام. يتم تقسيم البكتيريا إلى جرام (+) و جرام (-) وفقًا لهيكل جدار الخلية.
يحتوي جدار الخلية على أكبر كمية من الببتيدوغليكان (مورين) - وهي مادة معقدة ، والتي تشمل البيبتيد والجليكان. يتكون الجليكان من بقايا متناوبة لـ N-acetylglucosamine و N-acetylmuramic acid المرتبط ببعضهما البعض بواسطة β-1 ،4-روابط جليكوسيدية. يوفر Peptidoglycan صيانة شكل الخلية والحماية التناضحية ووظائف المستضد.
الاختلافات الرئيسية بين البكتيريا موجبة الجرام والبكتيريا سالبة الجرام
للبكتيريا المختلفة سماكة طبقة ببتيدوغليكان مختلفة. في البكتيريا المصنفة على أنها موجبة الجرام ، تتراوح من 15 إلى 80 نانومتر ، بينما في سالبة الجرام تتراوح من 2 إلى 8 نانومتر. في الوقت نفسه ، تمتلك البكتيريا سالبة الجرام بنية خاصة تحت طبقة الببتيدوغليكان ، والتي لا تمتلكها البكتيريا موجبة الجرام - المساحة المحيطة بالبلازما. تمتلئ هذه المساحة بالأنزيمات المتحللة للماء - β-lactamase و ribonuclease 1 و phosphatase. هذه الإنزيمات هي المسؤولة عن مقاومة البكتيريا سالبة الجرام للعديد من المضادات الحيوية.
طبقة الببتيدوغليكان الجرام (-) من البكتيريا مرتبطة بعديد السكاريد الدهني ، وهو هيكل مستضد يحتوي على سم داخلي. في بكتيريا الجرام (+) ، تؤدي الأحماض التيكويك وظائف مماثلة.
البكتيريا سالبة الجرام لها بنية إضافية - الغشاء الخارجي.
جوهر طريقة التلوين
قبل البدء في التلوين ، يتم تحضير مسحات من البكتيريا المدروسة. للقيام بذلك ، يتم تجفيف الماء على شريحة زجاجية ويتم إضافة ثقافة من الكائنات الحية الدقيقة هناك بحلقة بكتيرية. بعد ذلك ، بعد أن يجف الماء تمامًا ، يتم إصلاح اللطاخة - تُحمل الشريحة الزجاجية عدة مرات فوق لهب الموقد. تلطيخ الجرام أكثر فعالية من تلطيخ البكتيريا الحية - جزيئات الصبغة ترتبط بشكل أفضل بالخلايا الميتة.
يتم التلوين على عدة مراحل:
- يتم وضع قطع صغيرة من ورق الترشيح على مسحة ثابتة ويتم صب الصبغة الرئيسية - الجنطيانا البنفسجي أو الأزرق الميثيلين.
- بعد 3-5 دقائق ، قم بإزالة ورق الترشيح الملون واملأ اللطاخة بمحلول Lugol لمدة دقيقة واحدة. في هذه الحالة ، يغمق المستحضر.
- يتم تصريف محلول Lugol ويتم معالجة اللطاخة بكحول إيثيل نقي: يتم تقطير بضع قطرات على المستحضر ، ويتم تصريفها بعد 20 ثانية. يتم تكرار الإجراء 2-3 مرات
- اشطف شريحة الاختبار بالماء المقطر.
- إنتاج تلطيخ إضافي - قم بإنهاء التحضير باستخدام fuchsin. بعد 1-2 دقيقة ، يتم غسل الصبغة.
- بعد أن يجف الماء ، افحص اللطاخة تحت المجهر. ستكون البكتيريا موجبة الجرام باللون الأزرق البنفسجي ، والبكتيريا سالبة الجرام تكون وردية أو حمراء.
أسباب أنماط التلوين المختلفة
كما هو موصوف أعلاه ، تلطيخ الجرام للبكتيريا بقع البكتيريا موجبة الجرام الأزرق البنفسجي ، بينما البكتيريا سالبة الجرام تلطخ باللون الأحمر أو الوردي. سبب التلوين التفاضلي للبكتيريا بهذه الطريقة هو أنه بعد دخول الشكل القابل للذوبان من البنفسج الجنطيانا إلى الخلية ، تنتقل الصبغة إلى شكل اليود غير القابل للذوبان. أثناء معالجة البكتيريا بالكحول الإيثيلي ، يتم استخراج الدهون من الغشاء تحت تأثير هذا المذيب غير القطبي. ثم يصبح الغشاء مساميًا ولم يعد يمثل حاجزًا كبيرًا أمام صبغ الترشيح. لكنالببتيدوغليكان أكثر مقاومة للمذيبات غير القطبية ، بما في ذلك الكحول. هو الذي يمنع غسل الصبغة ، فتتحول البكتيريا ذات طبقة المورين السميكة إلى اللون الأزرق البنفسجي (موجبة الجرام) ، وبعد العلاج بالكحول لا تغير لونها.
طبقة مورين رقيقة من البكتيريا سالبة الجرام لا يمكنها الاحتفاظ بجزيئات الصبغة في الخلية ، لذلك بعد تأثير الكحول تصبح عديمة اللون - وصمة عار سالبة الجرام.
بعد التعرض لطخة الفوشسين ، تظل البكتيريا الملطخة بالجرام زرقاء بنفسجية ، بينما تصبح البكتيريا سالبة الجرام حمراء زهرية.
أمثلة للبكتيريا الجرام (+) والجرام (-)
البكتيريا سالبة الجرام تشمل البكتيريا الزرقاء ، بكتيريا الكبريت ، بكتيريا الحديد ، الكلاميديا ، الريكتسيا ، بكتيريا الأسيتيك ، العديد من بكتيريا الميثيلوبكتيريا ، البكتيريا الإثيونية ، البكتيريا الزرنية ، البكتيريا الكربوكسيلية.
Bifidobacteria والعديد من البكتيريا المائية والمكورات العقدية والمكورات العنقودية إيجابية الجرام.
