الامتصاص وإعادة انبعاث الضوء بواسطة الوسائط غير العضوية والعضوية هو نتيجة الفسفرة أو التألق. الفرق بين الظواهر هو طول الفترة الفاصلة بين امتصاص الضوء وانبعاث التيار. مع التألق ، تحدث هذه العمليات في وقت واحد تقريبًا ، ومع الفسفرة ، مع بعض التأخير.
الخلفية التاريخية
في عام 1852 ، وصف العالم البريطاني ستوكس الفلورة لأول مرة. لقد صاغ المصطلح الجديد نتيجة تجاربه مع الفلورسبار ، الذي ينبعث منه الضوء الأحمر عند تعرضه للأشعة فوق البنفسجية. لاحظ ستوكس ظاهرة مثيرة للاهتمام. وجد أن الطول الموجي لضوء الفلورسنت دائمًا أطول من طول ضوء الإثارة.
تم إجراء العديد من التجارب في القرن التاسع عشر لتأكيد الفرضية. أظهروا أن مجموعة متنوعة من العينات تتألق عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية. تشمل المواد ، من بين أمور أخرى ، البلورات والراتنجات والمعادن والكلوروفيل ،المواد الخام الطبية والمركبات غير العضوية والفيتامينات والزيوت. بدأ الاستخدام المباشر للأصباغ للتحليل البيولوجي فقط في عام 1930
وصف الفحص المجهري الإسفار
كانت بعض المواد المستخدمة في البحث في النصف الأول من القرن العشرين محددة للغاية. بفضل المؤشرات التي لا يمكن تحقيقها بطرق التباين ، أصبحت طريقة الفحص المجهري الفلورية أداة مهمة في كل من البحوث الطبية الحيوية والبيولوجية. كانت النتائج التي تم الحصول عليها ذات أهمية كبيرة لعلوم المواد.
ما هي فوائد الفحص المجهري الفلوري؟ بمساعدة مواد جديدة ، أصبح من الممكن عزل خلايا محددة للغاية ومكونات تحت المجهرية. يسمح لك المجهر الفلوري باكتشاف الجزيئات الفردية. تتيح لك مجموعة متنوعة من الأصباغ تحديد عدة عناصر في نفس الوقت. على الرغم من أن الدقة المكانية للمعدات محدودة بسبب حد الانعراج ، والذي يعتمد بدوره على الخصائص المحددة للعينة ، إلا أن اكتشاف الجزيئات تحت هذا المستوى ممكن أيضًا. تظهر العينات المختلفة تألق ذاتي بعد التشعيع. تستخدم هذه الظاهرة على نطاق واسع في صناعة البترول وعلم النبات وأشباه الموصلات.
الميزات
غالبًا ما تكون دراسة الأنسجة الحيوانية أو الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض معقدة إما بسبب التألق الذاتي الضعيف جدًا أو القوي جدًا. ومع ذلك ، فإن القيمة فييكتسب البحث مقدمة في مادة المكونات التي يتم تحفيزها عند طول موجي معين وتنبعث منها تدفق ضوئي بالشدة المطلوبة. تعمل الفلوروكرومات كصبغات قادرة على الارتباط الذاتي بالهياكل (غير مرئية أو مرئية). في الوقت نفسه ، تتميز بانتقائية عالية فيما يتعلق بالأهداف والعائد الكمي.
أصبح الفحص المجهري الفلوري مستخدمًا على نطاق واسع مع ظهور الأصباغ الطبيعية والاصطناعية. كان لديهم ملفات تعريف محددة لشدة الانبعاث والإثارة وكانوا يستهدفون أهدافًا بيولوجية محددة.
تحديد الجزيئات الفردية
في كثير من الأحيان ، في ظل ظروف مثالية ، يمكنك تسجيل وهج عنصر واحد. للقيام بذلك ، من بين أمور أخرى ، من الضروري ضمان انخفاض ضوضاء الكاشف والخلفية البصرية بشكل كافٍ. يمكن لجزيء الفلورسين أن يصدر ما يصل إلى 300000 فوتون قبل تدميره بسبب التبييض الضوئي. مع معدل تحصيل 20٪ وكفاءة عملية ، يمكن تسجيلهم بمبلغ حوالي 60 ألف
المجهري الفلوري ، القائم على الثنائيات الضوئية الانهيار الجليدي أو مضاعفة الإلكترون ، سمح للباحثين بمراقبة سلوك الجزيئات الفردية لمدة ثوانٍ ، وفي بعض الحالات دقائق.
صعوبات
المشكلة الرئيسية هي قمع الضوضاء من الخلفية البصرية. نظرًا لحقيقة أن العديد من المواد المستخدمة في إنشاء المرشحات والعدسات تظهر بعض التألق الذاتي ، فقد تركزت جهود العلماء في المراحل الأولية على إصدارمكونات ذات تألق منخفض. ومع ذلك ، أدت التجارب اللاحقة إلى استنتاجات جديدة. على وجه الخصوص ، تم العثور على الفحص المجهري الفلوري القائم على الانعكاس الداخلي الكلي لتحقيق خلفية منخفضة وإخراج ضوئي عالي الإثارة.
آلية
مبادئ الفحص المجهري الفلوري المستندة إلى الانعكاس الداخلي الكلي هي استخدام موجة تتحلل بسرعة أو غير منتشرة. ينشأ عند السطح البيني بين الوسائط بمؤشرات انكسار مختلفة. في هذه الحالة ، يمر شعاع الضوء من خلال منشور. معامل انكسار عالي
المنشور مجاور لمحلول مائي أو زجاج منخفض المعلمة. إذا تم توجيه شعاع الضوء إليه بزاوية أكبر من الزاوية الحرجة ، فإن الشعاع ينعكس تمامًا من الواجهة. هذه الظاهرة ، بدورها ، تؤدي إلى ظهور موجة غير متكاثرة. بمعنى آخر ، يتم إنشاء مجال كهرومغناطيسي يخترق وسطًا بمؤشر انكسار أقل على مسافة أقل من 200 نانومتر.
في الموجة غير المنتشرة ، ستكون شدة الضوء كافية تمامًا لإثارة الفلوروفورات. ومع ذلك ، نظرًا لعمقها الضحل بشكل استثنائي ، سيكون حجمها صغيرًا جدًا. والنتيجة هي خلفية منخفضة المستوى.
تعديل
يمكن تحقيق الفحص المجهري الفلوري المستند إلى الانعكاس الداخلي الكلي بإضاءة epi.يتطلب هذا عدسات ذات فتحة عددية متزايدة (1.4 على الأقل ، لكن من المرغوب أن تصل إلى 1.45-1.6) ، بالإضافة إلى مجال مضاء جزئيًا للجهاز. هذا الأخير يتحقق مع بقعة صغيرة. لمزيد من التوحيد ، يتم استخدام حلقة رفيعة يتم من خلالها حظر جزء من التدفق. للحصول على زاوية حرجة يحدث بعدها الانعكاس الكلي ، هناك حاجة إلى مستوى عالٍ من الانكسار لوسط الغمر في العدسات وغطاء الزجاج المجهر.
