الكائنات الحية الدقيقة في الطبيعة من حولنا موجودة في كل مكان: في التربة ، المسطحات المائية ، على أسطح الكائنات المختلفة ، يسكنها الناس والحيوانات. كل هذا يمكن أن يكون بمثابة مصادر للتلوث الجرثومي للأغذية والأدوية وخطوط الإنتاج. إن زراعة البكتيريا ضرورية لدراسة خصائصها واحتياجاتها وخصائصها. وهذا بدوره يعد خطوة مهمة في تطوير الأدوية المختلفة ، والتشخيص المخبري للأمراض ، وحساب مفاعلات الإنتاج وأكثر من ذلك بكثير.
مفاهيم عامة
تشير زراعة البكتيريا في علم الأحياء الدقيقة إلى زراعة الكائنات الحية الدقيقة التي يتم إجراؤها في المختبر. في المقابل ، تسمى الميكروبات التي نمت على وسط غذائي محدد ثقافة. يمكن خلط الثقافات إذا تكونت من أنواع مختلفة من الكائنات الحية الدقيقة ، وتكون نقية إذا تم تمثيلها بنوع واحد فقط من البكتيريا.
إذا كانت غذائيةيتم وضع خلية واحدة فقط في الوسط ، ويتم الحصول على مجموعة من الأفراد نتيجة تكاثرها ، ثم تسمى هذه المجموعة من الكائنات الحية الدقيقة استنساخ. عندما يتطور الاستنساخ إلى النقطة التي يصبح فيها مرئيًا للعين المجردة ، فإن هذه المجموعة من البكتيريا تسمى مستعمرة.
عادة ما تتم زراعة البكتيريا المعزولة من مصادر مختلفة بشكل منفصل عن بعضها البعض. كل مجموعة من الميكروبات المزروعة بشكل منفصل تسمى سلالة. لذلك ، إذا تم عزل نوع واحد من المكورات العنقودية من ثلاثة مصادر (أو أجزاء مختلفة من نفس المنتج ، وأشخاص مختلفين) ، فإنهم يتحدثون عن ثلاث سلالات من هذا النوع من المكورات العنقودية.
عوامل نمو البكتيريا
وتشمل هذه الأحماض الأمينية المختلفة ، والدهون ، وقواعد البيورين والمركبات الأخرى اللازمة لتطوير الكائنات الحية الدقيقة. يمكن لبعض الميكروبات إنتاج المواد التي تحتاجها بشكل مستقل ، بينما يحتاج البعض الآخر إلى تلقيها في شكلها النهائي. وفقًا لاحتياجات الكائنات الحية الدقيقة في بعض عوامل النمو ، يتم تحديد البكتيريا وتمايزها. أيضًا ، هذه المعلمة مهمة للتحضير الصحيح لوسط المغذيات لعمل المختبر والتكنولوجيا الحيوية:
- أحماض أمينية. قد تتطلب البكتيريا حمض أميني معين أو مجموعة من الأحماض. لذلك ، تحتاج المطثيات ليسين وتيروزين ، وتحتاج العقديات ليسين وأرجينين. تسمى الكائنات الحية الدقيقة التي تتطلب أحماض أمينية من الخارج لتنمو بـ auxotrophs.
- قواعد البيورين والبيريميدين ومشتقاتهما (الأدينين والجوانين وغيرها). هم عامل مهم في نمو الكثيرينالأنواع العقدية.
- فيتامينات. هم جزء من الإنزيمات المساعدة التي تتطلبها البكتيريا. لذلك ، فإن حمض النيكوتينيك ، بالإضافة إلى أميده ، الذي يعد جزءًا من NAD و NADP ، يحتاجه الخناق والبكتيريا الوتدية. الثيامين ، كجزء لا يتجزأ من بيروفوسفات ، مطلوب من قبل المكورات العنقودية الذهبية ، المكورات الرئوية ، البروسيلا. حمض البانتوثنيك ، وهو جزء من أنزيم CoA ، مطلوب بواسطة عصيات الكزاز وأنواع معينة من المكورات العقدية. السيتوكرومات ، وبالتالي حمض الفوليك ، والهيمات والبيوتين التي تشكلها ، ضرورية لمرض السل المتفطرة والمستدمية النزلية.
متطلبات البيئة
شروط وسائط الثقافة لزراعة البكتيريا:
- التغذية. يجب أن تحتوي ، علاوة على ذلك ، على مواد ، في شكل سهل الهضم ، وضرورية للكائنات الحية الدقيقة لتغذية وتجديد الطاقة. وتشمل هذه الكائنات العضوية والمعادن. تتطلب بعض الكائنات الحية الدقيقة أيضًا فيتامينات وأحماض أمينية لا يمكنها تصنيعها.
- مستوى الأس الهيدروجيني الأمثل. إنه يؤثر على نفاذية غشاء الخلية ، وبالتالي على القدرة على امتصاص العناصر الغذائية بواسطة البكتيريا. في أغلب الأحيان ، يجب أن تكون قيمة الأس الهيدروجيني عند المستوى 7 ، 2-7 ، 4. تنتج العديد من الكائنات الحية الدقيقة خلال حياتها منتجات ذات تفاعلات حمضية أو قلوية ، ولكي لا يتغير الرقم الهيدروجيني لوسط المغذيات ، يجب أن تكون مخزنة.
- متساوي التوتر. يجب أن يكون للضغط الاسموزي في وسط المغذيات لزراعة البكتيريا نفس القيمداخل الخلايا الميكروبية. عادة ما يتوافق مع محلول كلوريد الصوديوم 0.5٪.
- العقم. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ظهور البكتيريا الأجنبية سيشوه نتائج دراسة السلالة التي تم تحليلها.
- مستوى الرطوبة. يجب أن يكون لهذا المؤشر ، إلى جانب اتساق الوسط ، الخصائص المثالية لنوع معين من البكتيريا.
- إمكانات الأكسدة والاختزال (RH2). يوضح نسبة المواد التي تتبرع بالإلكترونات وتقبلها ، بالإضافة إلى مستوى تشبع الأكسجين في وسط المغذيات. بالنسبة للأيروبس واللاهوائية ، تختلف شروط زراعة البكتيريا إلى حد ما في هذا المؤشر. تتكاثر الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية بشكل أفضل عند قيم RH2 الأقل من 5 والكائنات الدقيقة الهوائية على الأقل 10.
- التوحيد. من المهم أن يحتوي وسط المزرعة على كميات ثابتة من مكوناته الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، يفضل الحلول الواضحة ، مما يسهل مراقبة نمو المحاصيل أو ملاحظة التلوث.
أنواع الإعلام الثقافي
اختيار وسيلة معينة لنمو الكائنات الحية الدقيقة يتأثر بالعديد من العوامل ، من بينها خصائص التغذية والغرض من الدراسة. السمات الرئيسية لتصنيف وسائط المغذيات هي:
1. عناصر. وفقًا للمواد الأولية المستخدمة في إنشاء الركيزة ، فإنها تميز:
- طبيعي ، يتم تحضيره من منتجات من أصل حيواني أو نباتي (مثل اللحوم والحليب والفاكهة) ومناسبة للزراعة المختلطةالمحاصيل ؛
- شبه اصطناعية ، حيث يتم استبدال المنتجات الغذائية الطبيعية باهظة الثمن بمنتجات غير غذائية (على سبيل المثال ، وجبة العظام ، والجلطات الدموية) ، والتي تعتبر مثالية لزراعة أنواع معينة من البكتيريا أو عزل منتجاتها الأيضية عن البيئة ؛
- تركيبي ، يتم تحضيره من كميات دقيقة من المركبات الكيميائية ، له تركيبة ثابتة معروفة ويمكن استنساخها بسهولة.
2. الاتساق (الكثافة). البيئات المميزة:
- سائل
- كثيف ؛
- شبه سائل.
تم تحضير الأخيرين من محاليل خاصة أو مواد سائلة مع إضافة أجار أجار أو الجيلاتين لإنشاء الكثافة المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البيئة الكثيفة لنمو البكتيريا هي مصل الدم المتخثر ، والبطاطا ، ووسائط هلام السيليكا ، والكاراجينان.
3. مُجَمَّع. على هذا الأساس ، البيئات هي:
- بسيطة ، والقائمة المختصرة هي مرق اللحم الببتون (MBB) ، مرق Hottinger and Agar ، Meat Peptone Agar (MPA) ، الجيلاتين المغذي وماء الببتون.
- مركب ، محضر من المواد البسيطة مع إضافة الدم ، مصل اللبن ، الكربوهيدرات ومواد أخرى.
4. ميعاد. يتم تمييز وسائط المغذيات التالية:
- main تستخدم لنمو العديد من الميكروبات المسببة للأمراض (تكوين بسيط عادة) ؛
- يتم استخدام أنواع خاصة لعزل وزراعة البكتيريا التي لا تنمو على ركائز بسيطة ؛
- انتقائية (فهي أيضًا انتقائية) مناسبة لعزل نوع معين من البكتيريا وتمنع نمو الميكروبات المرتبطة بها (انتقائيةتم إنشاؤه عن طريق إضافة مواد معينة إلى الوسائط ، مثل المضادات الحيوية أو الأملاح ، أو عن طريق ضبط درجة الحموضة) ؛
- تجعل التشخيصات التفاضلية من الممكن التمييز بين نوع من البكتيريا من خلال تقييم النشاط الأنزيمي ، على سبيل المثال ، للوسيط ؛
- المواد الحافظة ضرورية للتلقيح الأولي مع النقل اللاحق للعينات ، لأنها تمنع موت الكائنات الحية الدقيقة ، وكذلك تمنع نمو البكتيريا الأخرى.
إعداد الوسائط
أهم خطوة في زراعة البكتيريا اللاهوائية هي تحضير وسط غذائي مناسب. بعد تحديد المعلمات المثلى ، انتقل إلى المراحل التالية:
- الوزن ، عن طريق اختيار عينة من المكونات على ميزان تحليلي ؛
- الذوبان المنفذ في الماء المقطر المسخن إلى 70 درجة مئوية ، ويتم إذابة الفوسفات والمايكروسالتس بشكل منفصل ؛
- الغليان في حمام مائي لمدة دقيقتين
- تحديد الأس الهيدروجيني بواسطة ورقة المؤشر أو مقياس الجهد ؛
- الترشيح من خلال قطعة قماش مبللة أو مرشحات ورقية للسائل وكذلك الوسائط الكثيفة المنصهرة ، ومن خلال مرشح شاش قطني لوسائط أجار ؛
- تعبئة تتم بسعة 3/4 سعة ؛
- تعقيم متوسط الاعتماد ؛
- يتم التحكم في التعقيم عن طريق الاستقرار لمدة يومين في ترموستات ، متبوعًا بالمشاهدة ؛
- التحكم الكيميائي لتحديد الأس الهيدروجيني ومحتوى الضروريالعناصر ؛
- المكافحة البيولوجية عن طريق التلقيح التجريبي.
تعقيم الأواني الزجاجية والوسائط
العقم هو أحد المبادئ الأساسية للزراعة البكتيرية. يمكن أن يؤثر نمو وتطور الكائنات الحية الدقيقة الأجنبية على خصائص وسيط المغذيات عن طريق تغيير تركيبته الكيميائية ودرجة الحموضة. التعقيم هو الشرط الرئيسي لنمو الثقافات النقية. في الممارسة العملية ، يعني هذا المصطلح طرق تدمير جميع أشكال الحياة تمامًا على السطح وفي حجم الأشياء المعقمة. يتم تعقيم السفن والأدوات المستخدمة والوسائط والأشياء الأخرى المستخدمة أثناء الدراسة.
بعض أنواع التعقيم:
- اشتعال. يمكن تعقيم الحلقات والإبر للبذر ، والشرائح الزجاجية ، وبعض الأدوات باستخدام الموقد أو المصباح الروحي.
- الغليان. مناسبة للتعامل مع الحقن والإبر والغذاء ولكنها لا تقتل الأبواغ البكتيرية.
- التعقيم الحراري الجاف. يتم تنفيذه في خزانة تجفيف خاصة ومناسب لمعالجة القوارير وأنابيب الاختبار والأواني الزجاجية المخبرية الأخرى.
- التعقيم بالبخار. تُجرى هذه الطريقة في الأوتوكلاف ، وهي فعالة للغاية. لكنها غير مناسبة لوسائط المغذيات التي تحتوي على بروتينات أو أي مركبات أخرى تتحلل في درجات حرارة عالية. يمكن أن يسمى التجنيب أكثر من ذلك. يتم تنفيذه في غلاية كوخ ويجمع بين إنبات الجراثيم وتدميرها.
- بسترة. يتم استخدامه للوسائط التي تغير خصائصها عند الغليان (على سبيل المثال ، الحليب والنبيذ والبيرة) ، قادرة علىتخليصهم من الكائنات الحية الدقيقة غير البوغية. درجة حرارة المعالجة هي فقط 50-60 درجة مئوية لمدة خمسة عشر إلى ثلاثين دقيقة. في بعض الحالات يتم استخدام التعقيم البارد باستخدام الفلاتر أو الأشعة فوق البنفسجية.
ظروف زراعة البكتيريا
نمو البكتيريا وتطورها ممكن فقط في ظل عوامل معينة وقيم كل منها:
1. درجة حرارة. هناك ثلاث مجموعات من البكتيريا تختلف في درجة الحرارة المفضلة:
- الميكروبات المحبة للحرارة تنمو عند 45-90 درجة مئوية ، مما يعني أنها لا تتكاثر في الكائنات البشرية والحيوانية ؛
- الكائنات الحية الدقيقة ، أو الكائنات الحية الدقيقة المحبة للبرد ، تفضل درجات حرارة تتراوح بين 5-15 درجة مئوية وتزرع في مخازن التبريد ؛
- mesophiles ، تتطور عند درجة حرارة 25-37 درجة مئوية ، وهي تشمل الجزء الأكبر من البكتيريا.
2. خفيفة. إنها سمة من سمات زراعة البكتيريا الضوئية ، حيث أنها تنفذ عملية التمثيل الضوئي. لكن بالنسبة لمعظم الميكروبات ، فإن الإضاءة ليست شرطا مسبقا. والعكس صحيح ، يمكن للأشعة فوق البنفسجية الشمسية أن تثبط تطورها.
3. ماء. تحتاج جميع الكائنات الحية الدقيقة إلى الماء في شكل (سائل) يسهل الوصول إليه. هذا هو السبب في أن الطعام المجمد يحتوي على القليل من نمو البكتيريا أو لا ينمو على الإطلاق.
4. حموضة البيئة. تمت مناقشة مبدأ زراعة البكتيريا بالتفصيل أعلاه.
5. تهوية. الأكسجين ، كعنصر كيميائي ، هو جزء لا يتجزأ من الماء وعدد كبير من المركبات المستخدمةزراعة الكائنات الحية الدقيقة. يمكن أيضًا احتواء الأكسجين الغازي في الماء والسوائل الأخرى في صورة مذابة. يحتاج جزء كبير من البكتيريا إلى إمداد مستمر بجزيئات الأكسجين. لكن بالنسبة لعدد من الكائنات الحية الدقيقة ، من غير الضروري ، أو الأسوأ من ذلك ، أن الأكسجين الغازي سام بالنسبة لهم ، حيث لا يحتويون على الكاتلاز والبيروكسيديز ، مما يؤدي إلى تدمير المنتجات التنفسية السامة. لذلك ، فإن أهم خطوة في زراعة البكتيريا اللاهوائية هي إزالة جزيئات O2من وسط المغذيات.
6. زراعة الكائنات الحية الدقيقة. تتم زراعة البكتيريا الهوائية واللاهوائية في طبقات مختلفة من البيئة وفي أوضاع مختلفة.
زراعة الكائنات الدقيقة الهوائية
تتطلب زراعة البكتيريا الهوائية الأكسجين الجزيئي. للحصول على مزارع نقية من الأيروبس يمكن استخدامها بنجاح في الطب وصناعة الأغذية ، يتم استخدام الطرق التالية:
- سطح ينمو على وسط كثيف أو في وسط سائل (طبقته الرقيقة) عندما يأتي الأكسجين مباشرة من الهواء ؛
- الزراعة العميقة في الوسط السائل ، عندما تتحقق زيادة كمية الأكسجين المذاب فيها عن طريق التهوية المستمرة.
زراعة الكائنات الدقيقة اللاهوائية
المبدأ الأساسي لزراعة البكتيريا من هذا النوع هو الحد الأدنى من ملامستها للأكسجين الجوي. إن توفير الظروف لنموها أصعب بكثير من الأيروبس. يتم استخدام الطرق التالية لعزل اللاهوائية عن الجزيئي O2:
- جسدي. يتم تقليل طريقة زراعة البكتيريا اللاهوائية إلى زراعتها في جهاز فراغ خاص - ميكروانايروستات. يتم استبدال الهواء بخليط غاز خاص من النيتروجين مع إضافة 10٪ هيدروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
- كيميائي. وتشمل هذه: استخدام عوامل الامتصاص (على سبيل المثال Fe ، Na2S2O4، CuCl) أو الاختزال (مثل حمض الأسكوربيك).
- بيولوجي. يتعلق الأمر بالزراعة المشتركة للأيروبس واللاهوائية في نظام مغلق. تتضمن طريقة زراعة البكتيريا هذه بذر نصف طبق بتري ببعض الأنواع الهوائية من البكتيريا ، والنصف الآخر بالبكتيريا اللاهوائية المدروسة. سيبدأ تطويره في اللحظة التي يتم فيها استهلاك كل الأكسجين.
طرق البذر التالية مناسبة لزراعة البكتيريا اللاهوائية:
- في الطبقة السطحية ؛
- في الطبقة السطحية المليئة بالبارافين المعقم ؛
- في غليظ وسط غذائي كثيف ؛
- في الطبقات العميقة من الوسائط اللزجة.
الحصول على ثقافة نقية
يعمل علماء الأحياء الدقيقة عادة مع عينات مأهولة بالعديد من أنواع الميكروبات المختلفة. ومع ذلك ، لتحديد الوضع المنهجي للكائنات الحية الدقيقة (الأسرة ، والجنس ، والأنواع) ، وكذلك دراسة خصائصها ، من الضروري عزلها وتنمية ثقافة نقية. إنها ذات أهمية كبيرة في العديد من الصناعات الغذائية ، على سبيل المثال ، الجبن ، الخبز ، الكفاس ، النبيذ ، إلخ. إن زراعة بكتيريا حمض اللاكتيك تجعل من الممكن الحصول عليهامكون أساسي لإنتاج منتجات الألبان المخمرة والعجين والكاكاو والسيلاج وحتى البلاستيك.
تعتمد طريقة عزل مزرعة نقية في وسط كثيف على الفصل الميكانيكي لخلايا الكائنات الحية الدقيقة مع زراعتها المعزولة اللاحقة. يتم نقل العينة إلى حجم معقم من الماء أو المحلول الملحي (حجم 10-100 مل) ثم رجها لمدة دقيقتين. من أجل استخراج الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في سمك المادة قيد الدراسة (على سبيل المثال ، النقانق أو الجبن) ، يتم أولاً فرك قطع العينة بأدوات معقمة بالرمل. يتم تخفيف المادة التي خضعت للتحضير الأولي ، والتي تزن 1 جم أو حجم 1 مل ، بالماء المعقم بمقدار 10 ، 100 ، 1000 ، إلخ. يتم اختيار درجة التخفيف التي تعطي تركيزًا للخلايا يتوافق مع إمكانيات الطريقة.
الزراعة اللاحقة للكائنات الحية الدقيقة هي تحضير وسط غذائي. عادة يتم اختيار وسط كثيف (MPA). يتم صهره أولاً وتبريده إلى 45-50 درجة مئوية ، وبعد ذلك فقط يتم سكبه في عدة أطباق بتري (من ثلاث إلى خمس قطع) ، يتم وضع مسحات من مادة الاختبار بتركيزات مختلفة في قاعها. بعد ذلك ، يتم خلط وسيط المغذيات الذي لم يتم تجميده والمواد التي يتم إدخالها فيه. هذه هي الطريقة التي يتم بها إصلاح الخلايا في نقاط مختلفة في حجم الركيزة.
بعد ذلك ، يتم وضع أطباق بتري في منظم حرارة لمدة يومين عند 22 درجة مئوية. خلال هذا الوقت ، تتكاثر الخلايا لدرجة أن المستعمرة التي تكونت بواسطة كل خلية تصبح مرئية للعين المجردة. كل واحد منهم عبارة عن مزرعة نقية لنوع البكتيريا التي من خلاياهاارتفع
بعد ذلك ، من أطباق بتري ، تتم زراعة الكائنات الحية الدقيقة في أنابيب اختبار منفصلة مملوءة بوسط غذائي. بهذه الطريقة ، يتم عزل الثقافات النقية من عينة مختلطة. هذه الطريقة تحمل اسم مطورها - R. Koch. وتسمى أيضًا طريقة الكوب ، أو البذر المستنفد. بعد الحصول على مزارع نقية لأنواع مختلفة من البكتيريا ، يتم تحديد شكلها وجراثيمها وعائلاتها.
يجب تنفيذ جميع الأعمال وفقًا لمبادئ التعقيم. لتجنب التطور المبكر للكائنات الحية الدقيقة ، يجب إجراء الدراسة فور أخذ العينات. يتم تحليل مياه الصنبور بعد تصريف الأجزاء الأولى ، لأنها قد تحتوي على ميكروبات متراكمة في الأنابيب والصنابير. توجد النباتات الدقيقة للفواكه والتوت والخضروات بشكل أساسي على السطح (قشر) ، لذلك يتم إجراء عمليات الغسيل منها. للقيام بذلك ، ضع الجنين في وعاء معقم واملأه بالكمية المطلوبة من الماء. ثم يتم رجها بقوة ويسكب الماء في وعاء آخر. يتم أيضًا الحصول على محاصيل من منتجات القماش في مسحات ، ولكن مسبقًا ، يتم قطع قطع ذات حجم معين منها.
