البروتين مكون أساسي لجميع الكائنات الحية. يتكون كل جزيء من جزيئاته من واحد أو أكثر من سلاسل بولي ببتيد تتكون من أحماض أمينية. على الرغم من أن المعلومات الضرورية للحياة يتم ترميزها في DNA أو RNA ، تؤدي البروتينات المؤتلفة مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية في الكائنات الحية ، بما في ذلك التحفيز الأنزيمي ، والحماية ، والدعم ، والحركة ، والتنظيم. وفقًا لوظائفها في الجسم ، يمكن تقسيم هذه المواد إلى فئات مختلفة ، مثل الأجسام المضادة والإنزيمات والمكونات الهيكلية. نظرًا لوظائفها المهمة ، فقد تمت دراسة هذه المركبات بشكل مكثف واستخدامها على نطاق واسع.
في الماضي ، كانت الطريقة الرئيسية للحصول على البروتين المؤتلف هي عزله عن مصدر طبيعي ، والذي عادة ما يكون غير فعال ويستغرق وقتًا طويلاً. جعلت التطورات الحديثة في التكنولوجيا الجزيئية البيولوجية من الممكن استنساخ ترميز الحمض النووي لمجموعة معينة من المواد في ناقل تعبير لمواد مثل البكتيريا والخميرة وخلايا الحشرات وخلايا الثدييات.
ببساطة ، يتم ترجمة البروتينات المؤتلفة بواسطة منتجات DNA خارجية إلىخلايا حية. عادةً ما يتضمن الحصول عليها خطوتين رئيسيتين:
- استنساخ جزيء
- تعبير البروتين.
حاليًا ، يعد إنتاج مثل هذا الهيكل من أقوى الطرق المستخدمة في الطب وعلم الأحياء. التركيب له تطبيق واسع في البحث والتكنولوجيا الحيوية.
الاتجاه الطبي
توفر البروتينات المؤتلفة علاجات مهمة لمختلف الأمراض مثل مرض السكري والسرطان والأمراض المعدية والهيموفيليا وفقر الدم. تشتمل التركيبات النموذجية لهذه المواد على الأجسام المضادة والهرمونات والإنترلوكينات والإنزيمات ومضادات التخثر. هناك حاجة متزايدة للتركيبات المؤتلفة للاستخدام العلاجي. أنها تسمح لك بتوسيع طرق العلاج.
تلعب البروتينات المؤتلفة المعدلة وراثيًا دورًا رئيسيًا في سوق الأدوية العلاجية. تنتج خلايا الثدييات حاليًا أكثر العوامل العلاجية لأن تركيباتها قادرة على إنتاج مواد عالية الجودة شبيهة بالطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إنتاج العديد من البروتينات العلاجية المؤتلفة المعتمدة في الإشريكية القولونية بسبب الوراثة الجيدة ، والنمو السريع ، والإنتاجية العالية. كما أن لها تأثير إيجابي على تطوير الأدوية القائمة على هذه المادة.
بحث
يعتمد الحصول على البروتينات المؤتلفة على طرق مختلفة. المواد تساعد على معرفة المبادئ الأساسية والأساسية للجسم. يمكن استخدام هذه الجزيئات لتحديد وتحديدموقع المادة المشفرة بواسطة جين معين ، والكشف عن وظيفة الجينات الأخرى في الأنشطة الخلوية المختلفة مثل إشارات الخلية ، والتمثيل الغذائي ، والنمو ، والتكرار والموت ، والنسخ ، والترجمة ، وتعديل المركبات التي تمت مناقشتها في المقالة.
وهكذا ، غالبًا ما يتم استخدام التركيبة المرصودة في البيولوجيا الجزيئية ، وبيولوجيا الخلية ، والكيمياء الحيوية ، والدراسات الهيكلية والفيزيائية الحيوية والعديد من مجالات العلوم الأخرى. في الوقت نفسه ، يعد الحصول على البروتينات المؤتلفة ممارسة دولية.
هذه المركبات هي أدوات مفيدة في فهم التفاعلات بين الخلايا. لقد أثبتت فعاليتها في العديد من الطرق المعملية مثل ELISA والكيمياء المناعية (IHC). يمكن استخدام البروتينات المؤتلفة لتطوير فحوصات الإنزيم. عند استخدامها مع زوج من الأجسام المضادة المناسبة ، يمكن استخدام الخلايا كمعايير للتقنيات الجديدة.
التكنولوجيا الحيوية
تستخدم البروتينات المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية أيضًا في الصناعة وإنتاج الأغذية والزراعة والهندسة الحيوية. على سبيل المثال ، في تربية الحيوانات ، يمكن إضافة الإنزيمات إلى الطعام لزيادة القيمة الغذائية لمكونات العلف ، وتقليل التكاليف والهدر ، ودعم صحة الأمعاء الحيوانية ، وتحسين الإنتاجية ، وتحسين البيئة.
بالإضافة إلى بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB) لفترة طويلةتم استخدامها لإنتاج الأطعمة المخمرة ، ومؤخراً تم تطوير LAB للتعبير عن البروتينات المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية ، والتي يمكن استخدامها على نطاق واسع ، على سبيل المثال ، لتحسين الهضم البشري والحيواني والتغذوي.
ومع ذلك ، فإن هذه المواد لها أيضًا قيود:
- في بعض الحالات ، يكون إنتاج البروتينات المؤتلفة معقدًا ومكلفًا ويستغرق وقتًا طويلاً.
- قد لا تتطابق المواد المنتجة في الخلايا مع الأشكال الطبيعية. يمكن أن يقلل هذا الاختلاف من فعالية البروتينات العلاجية المؤتلفة بل ويسبب آثارًا جانبية. بالإضافة إلى أن هذا الاختلاف قد يؤثر على نتائج التجارب.
- المشكلة الرئيسية مع جميع الأدوية المؤتلفة هي الاستمناع. يمكن لجميع منتجات التكنولوجيا الحيوية أن تظهر شكلاً من أشكال المناعة. من الصعب التنبؤ بسلامة البروتينات العلاجية الجديدة.
بشكل عام ، أدى التقدم في التكنولوجيا الحيوية إلى زيادة وتسهيل إنتاج البروتينات المؤتلفة لمجموعة متنوعة من التطبيقات. على الرغم من أنها لا تزال تحتوي على بعض العيوب ، إلا أن المواد مهمة في الطب والبحوث والتكنولوجيا الحيوية.
رابط المرض
البروتين المؤتلف ليس ضارًا للإنسان. إنه جزء لا يتجزأ فقط من الجزيء الكلي في تطوير دواء معين أو عنصر غذائي. أظهرت العديد من الدراسات الطبية أن التعبير القسري عن بروتين FGFBP3 (اختصاره BP3) في سلالة معملية من الفئران البدينة أظهر انخفاضًا كبيرًا في دهون الجسم.الكتلة ، على الرغم من الاستعداد الوراثي للاستخدام.
تظهر نتائج هذه التجارب أن بروتين FGFBP3 قد يقدم علاجًا جديدًا للاضطرابات المرتبطة بمتلازمة التمثيل الغذائي مثل مرض السكري من النوع 2 ومرض الكبد الدهني. ولكن نظرًا لأن BP3 هو بروتين طبيعي وليس دواءً صناعيًا ، فيمكن أن تبدأ التجارب السريرية لـ BP3 البشري المؤتلف بعد الجولة الأخيرة من الدراسات قبل السريرية. في ، أي هناك أسباب تتعلق بسلامة إجراء مثل هذه الدراسات. البروتين المؤتلف ليس ضارًا للإنسان بسبب معالجته وتنقيته التدريجية. التغييرات تحدث على المستوى الجزيئي أيضًا.
PD-L2 ، أحد اللاعبين الرئيسيين في العلاج المناعي ، تم ترشيحه لجائزة نوبل لعام 2018 في علم وظائف الأعضاء أو الطب. بدأ هذا العمل من قبل البروفيسور جيمس بي أليسون من الولايات المتحدة والبروفيسور تاسوكو هونجو من اليابان ، وقد أدى إلى علاج السرطانات مثل الورم الميلانيني وسرطان الرئة وغيرها بناءً على العلاج المناعي عند نقاط التفتيش. أضافت AMSBIO مؤخرًا منتجًا رئيسيًا جديدًا إلى خط العلاج المناعي الخاص بها ، وهو المنشط PD-L2 / TCR - CHO Recombinant Cell Line.
في تجارب إثبات المفهوم ، قام باحثون في جامعة ألاباما في برمنغهام ، بقيادة H. Long Zheng ، MD ، البروفيسور روبرت ب. لقد سلط الطب الضوء على علاج محتمل وهو اضطراب نزيف نادر ولكنه قاتل ، TTP.
نتائج هذاأثبتت الدراسات لأول مرة أن نقل الصفائح الدموية المحملة بـ rADAMTS13 قد يكون أسلوبًا علاجيًا جديدًا ومن المحتمل أن يكون فعالًا للتخثر الشرياني المرتبط بـ TTP الخلقي والمتوسط المناعي.
البروتين المؤتلف ليس فقط عنصرًا غذائيًا ، ولكنه أيضًا دواء في تكوين الدواء الذي يتم تطويره. هذه ليست سوى عدد قليل من المجالات التي تشارك الآن في الطب وتتعلق بدراسة جميع عناصره الهيكلية. كما تظهر الممارسة الدولية ، فإن بنية المادة تجعل من الممكن على المستوى الجزيئي التعامل مع العديد من المشاكل الخطيرة في جسم الإنسان.
تطوير لقاح
البروتين المؤتلف هو مجموعة محددة من الجزيئات التي يمكن نمذجتها. يتم استخدام خاصية مماثلة في تطوير اللقاحات. قال باحثون من جامعة إدنبرة ومعهد بيربرايت إن استراتيجية التطعيم الجديدة ، المعروفة أيضًا باسم استخدام حقنة خاصة من الفيروس المؤتلف ، يمكن أن تحمي ملايين الدجاج المعرضة لخطر الإصابة بأمراض تنفسية خطيرة. تستخدم هذه اللقاحات نسخًا غير ضارة أو ضعيفة من فيروس أو بكتيريا لإدخال الجراثيم إلى خلايا الجسم. في هذه الحالة ، استخدم الخبراء فيروسات مأشوبة ببروتينات سبايك مختلفة كلقاحات لإنشاء نسختين من فيروس غير ضار. هناك العديد من الأدوية المختلفة التي تم إنشاؤها حول هذا الاتصال.
الأسماء التجارية للبروتين المؤتلف ونظائرها كما يلي:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "إيليا".
هذه أدوية مضادة للسرطان بشكل أساسي ، ولكن هناك مجالات علاج أخرى مرتبطة بهذه المادة الفعالة.
لقاح جديد ، يسمى أيضًا LASSARAB ، مصمم لحماية الناس من كل من حمى لاسا وداء الكلب ، أظهر نتائج واعدة في الدراسات قبل السريرية ، وفقًا لدراسة جديدة نُشرت في المجلة العلمية Nature Communications. لقاح معطل مؤشب مرشح يستخدم فيروس داء الكلب ضعيف.
قام فريق البحث بإدخال مادة وراثية لفيروس لاسا في ناقل فيروس داء الكلب بحيث يعبر اللقاح عن البروتينات السطحية في كل من خلايا لاسا وداء الكلب. تثير هذه المركبات السطحية استجابة مناعية ضد العوامل المعدية. ثم تم تعطيل هذا اللقاح "لتدمير" فيروس داء الكلب الحي المستخدم في صنع الناقل.
الحصول على الأساليب
هناك عدة أنظمة لإنتاج مادة ما. تعتمد الطريقة العامة للحصول على البروتين المؤتلف على الحصول على مادة بيولوجية من التوليف. لكن هناك طرق أخرى.
يوجد حاليًا خمسة أنظمة تعبير رئيسية:
- E. نظام التعبير القولونية.
- نظام التعبير الخميرة.
- نظام التعبير عن خلية الحشرات.
- نظام التعبير عن الخلايا الثديية.
- نظام التعبير البروتيني الخالي من الخلايا.
الخيار الأخير مناسب بشكل خاص للتعبير عن بروتينات الغشاءوالمركبات السامة. في السنوات الأخيرة ، تم دمج المواد التي يصعب التعبير عنها بالطرق التقليدية داخل الخلايا بنجاح في الخلايا في المختبر. في بيلاروسيا ، يتم استخدام إنتاج البروتينات المؤتلفة على نطاق واسع. هناك عدد من الشركات المملوكة للدولة تتعامل مع هذه القضية.
نظام تخليق البروتين الخالي من الخلايا هو طريقة سريعة وفعالة لتركيب المواد المستهدفة عن طريق إضافة ركائز مختلفة ومركبات الطاقة اللازمة للنسخ والترجمة في النظام الأنزيمي للمستخلصات الخلوية. في السنوات الأخيرة ، ظهرت تدريجياً مزايا الطرق الخالية من الخلايا لأنواع المواد مثل الأغشية المعقدة والسامة ، مما يدل على إمكانية تطبيقها في مجال الصيدلة الحيوية.
يمكن للتكنولوجيا الخالية من الخلايا أن تضيف مجموعة متنوعة من الأحماض الأمينية غير الطبيعية بسهولة وبطريقة خاضعة للرقابة لتحقيق عمليات تعديل معقدة يصعب حلها بعد التعبير المؤتلف التقليدي. هذه الأساليب لها قيمة تطبيق عالية وإمكانية لإيصال الأدوية وتطوير اللقاح باستخدام جزيئات تشبه الفيروسات. تم التعبير عن عدد كبير من بروتينات الغشاء بنجاح في الخلايا الحرة.
التعبير عن التراكيب
بروتين مؤتلف CFP10-ESAT 6 يتم إنتاجه واستخدامه لإنتاج اللقاحات. يسمح لك هذا النوع من مسببات الحساسية من السل بتقوية جهاز المناعة وتطوير الأجسام المضادة. بشكل عام ، تشمل الدراسات الجزيئية دراسة أي جانب من جوانب البروتين ، مثل البنية أو الوظيفة أو التعديلات أو التوطين أو التفاعلات. للاستكشافكيف تنظم مواد معينة العمليات الداخلية ، يحتاج الباحثون عادة إلى وسائل لإنتاج مركبات وظيفية ذات فائدة وفائدة.
نظرًا لحجم البروتينات وتعقيدها ، فإن التخليق الكيميائي ليس خيارًا قابلاً للتطبيق لهذا المسعى. بدلاً من ذلك ، عادةً ما تُستخدم الخلايا الحية وآلاتها الخلوية كمصانع لإنشاء وبناء المواد بناءً على القوالب الجينية المتوفرة. يقوم نظام التعبير عن البروتين المؤتلف بعد ذلك بتوليد البنية اللازمة لإنشاء دواء. بعد ذلك يأتي اختيار المواد اللازمة لمختلف فئات الأدوية.
على عكس البروتينات ، يسهل تكوين الحمض النووي صناعياً أو في المختبر باستخدام تقنيات إعادة الارتباط الراسخة. لذلك ، يمكن تصميم قوالب الحمض النووي لجينات معينة ، مع أو بدون تسلسل مراسل مضاف أو تسلسل علامات التقارب ، كقوالب للتعبير عن المادة المراقبة. تسمى هذه المركبات المشتقة من قوالب الحمض النووي هذه بالبروتينات المؤتلفة.
تشتمل الاستراتيجيات التقليدية للتعبير عن مادة ما على نقل العدوى بنواقل الحمض النووي التي تحتوي على قالب ثم استنبات الخلايا لنسخ البروتين المطلوب وترجمته. عادة ، يتم بعد ذلك تحليل الخلايا لاستخراج المركب المعبر عنه للتنقية اللاحقة. تتم معالجة البروتين المؤتلف CFP10-ESAT6 بهذه الطريقة ويخضع لنظام تنقية ممكنتكوين السموم. فقط بعد ذلك يتم تصنيعه في لقاح.
يتم استخدام كل من أنظمة التعبير بدائية النواة وحقيقية النواة في الجسم الحي للمواد الجزيئية على نطاق واسع. يعتمد اختيار النظام على نوع البروتين ومتطلبات النشاط الوظيفي والعائد المطلوب. تشمل أنظمة التعبير هذه الثدييات والحشرات والخمائر والبكتيريا والطحالب والخلايا. لكل نظام مزايا وتحديات خاصة به ، واختيار النظام المناسب لتطبيق معين مهم للتعبير الناجح للمادة قيد المراجعة.
تعبير من الثدييات
يسمح استخدام البروتينات المؤتلفة بتطوير لقاحات وأدوية من مستويات مختلفة. لهذا ، يمكن استخدام طريقة الحصول على مادة ما. يمكن استخدام أنظمة تعبير الثدييات لإنتاج البروتينات من المملكة الحيوانية التي تتمتع بأكبر بنية ونشاط أصلي بسبب بيئتها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ينتج عن هذا مستويات عالية من المعالجة اللاحقة للترجمة والنشاط الوظيفي. يمكن استخدام أنظمة التعبير عن الثدييات لإنتاج الأجسام المضادة والبروتينات المعقدة والمركبات لاستخدامها في الاختبارات الوظيفية القائمة على الخلايا. ومع ذلك ، تقترن هذه الفوائد بشروط ثقافية أكثر صرامة.
يمكن استخدام أنظمة تعبير الثدييات لتوليد البروتينات بشكل عابر أو من خلال خطوط الخلايا المستقرة حيث يتم دمج بنية التعبير في جينوم المضيف. بينما يمكن استخدام هذه الأنظمة في تجارب متعددة ، فإن الوقتيمكن أن ينتج عن الإنتاج كمية كبيرة من المادة في غضون أسبوع إلى أسبوعين. هناك طلب كبير على هذا النوع من التكنولوجيا الحيوية للبروتين المؤتلف.
تستخدم أنظمة تعبير الثدييات العابرة وعالية الغلة مزارع تعليق ويمكن أن تنتج جرامات لكل لتر. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي هذه البروتينات على المزيد من التعديلات الأصلية القابلة للطي وما بعد الترجمة مثل الارتباط بالجليكوزيل مقارنة بأنظمة التعبير الأخرى.
التعبير عن الحشرات
لا تقتصر طرق إنتاج البروتين المؤتلف على الثدييات. هناك أيضًا طرق أكثر إنتاجية من حيث تكاليف الإنتاج ، على الرغم من أن عائد المادة لكل 1 لتر من السائل المعالج أقل بكثير.
يمكن استخدام خلايا الحشرات للتعبير عن بروتين عالي المستوى مع تعديلات مشابهة لأنظمة الثدييات. هناك العديد من الأنظمة التي يمكن استخدامها لتوليد الفيروس البكتيري المؤتلف ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لاستخراج المادة ذات الأهمية في خلايا الحشرات.
يمكن توسيع نطاق تعبيرات البروتينات المؤتلفة بسهولة وتكييفها مع ثقافة التعليق عالية الكثافة من أجل تركيب الجزيئات على نطاق واسع. هم أكثر تشابهًا وظيفيًا للتكوين الأصلي للمادة الثديية. على الرغم من أن المحصول يمكن أن يصل إلى 500 ملجم / لتر ، إلا أن إنتاج الفيروس البكتيري المؤتلف يمكن أن يستغرق وقتًا طويلاً وتكون ظروف الاستزراع أكثر صعوبة من الأنظمة بدائية النواة. ومع ذلك ، في البلدان الجنوبية والأكثر دفئا ، مماثلةتعتبر الطريقة أكثر كفاءة.
تعبير بكتيري
يمكن إنشاء إنتاج البروتينات المؤتلفة بمساعدة البكتيريا. تختلف هذه التقنية كثيرًا عن تلك الموضحة أعلاه. تحظى أنظمة التعبير عن البروتينات البكتيرية بشعبية لأن البكتيريا سهلة الاستزراع وتنمو بسرعة وتعطي عوائد عالية من التركيبة المؤتلفة. ومع ذلك ، فإن المواد حقيقية النواة متعددة المجالات التي يتم التعبير عنها في البكتيريا غالبًا ما تكون غير وظيفية لأن الخلايا غير مجهزة لإجراء التعديلات الضرورية بعد الترجمة أو الطي الجزيئي.
بالإضافة إلى ذلك ، تصبح العديد من البروتينات غير قابلة للذوبان كجزيئات متضمنة ، والتي يصعب للغاية استعادتها بدون عوامل تغيير طبيعة قاسية وإجراءات الانكسار الجزيئي المرهقة اللاحقة. تعتبر هذه الطريقة في الغالب أنها لا تزال تجريبية إلى حد كبير.
خلية حرية التعبير
يتم الحصول على البروتين المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية للمكورات العنقودية بطريقة مختلفة قليلاً. يتم تضمينه في العديد من أنواع الحقن ، مما يتطلب عدة أنظمة قبل الاستخدام.
تعبير البروتين الخالي من الخلايا عبارة عن تخليق في المختبر لمادة باستخدام مستخلصات الخلايا الكاملة المتوافقة مع الترجمة. من حيث المبدأ ، تحتوي مستخلصات الخلية الكاملة على جميع الجزيئات والمكونات المطلوبة للنسخ والترجمة وحتى التعديل بعد الترجمة.
هذه المكونات تشمل RNA polymerase وعوامل البروتين التنظيمية وأشكال النسخ والريبوسومات و tRNA. عند إضافةالعوامل المساعدة والنيوكليوتيدات ونموذج جيني محدد ، يمكن لهذه المقتطفات توليف البروتينات المهمة في غضون ساعات قليلة.
على الرغم من أنها ليست مستدامة للإنتاج على نطاق واسع ، فإن أنظمة التعبير عن البروتينات الخالية من الخلايا أو في المختبر (IVT) تقدم عددًا من المزايا على الأنظمة التقليدية في الجسم الحي.
يسمح التعبير الخالي من الخلايا بالتوليف السريع للتركيبات المؤتلفة دون إشراك زراعة الخلايا. تجعل الأنظمة الخالية من الخلايا من الممكن تصنيف البروتينات بالأحماض الأمينية المعدلة ، وكذلك للتعبير عن المركبات التي تخضع لتحلل سريع للبروتين بواسطة البروتياز داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، من الأسهل التعبير عن العديد من البروتينات المختلفة في نفس الوقت باستخدام طريقة خالية من الخلايا (على سبيل المثال ، اختبار طفرات البروتين عن طريق التعبير على نطاق صغير من العديد من قوالب الحمض النووي المؤتلف المختلفة). في هذه التجربة التمثيلية ، تم استخدام نظام IVT للتعبير عن بروتين كاسباس -3 البشري.
الاستنتاجات والآفاق المستقبلية
يمكن الآن اعتبار إنتاج البروتين المؤتلف نظامًا ناضجًا. هذا هو نتيجة العديد من التحسينات الإضافية في التنقية والتحليل. حاليًا ، نادرًا ما تتوقف برامج اكتشاف الأدوية بسبب عدم القدرة على إنتاج البروتين المستهدف. العمليات الموازية للتعبير عن العديد من المواد المؤتلفة وتنقيتها وتحليلها معروفة الآن في العديد من المختبرات حول العالم.
مجمعات بروتينية ونجاح متزايد في صنعهاستتطلب هياكل الأغشية المذابة مزيدًا من التغييرات لمواكبة الطلب. إن ظهور منظمات أبحاث تعاقدية فعالة من أجل إمداد أكثر انتظامًا بالبروتينات سيسمح بإعادة تخصيص الموارد العلمية لمواجهة هذه التحديات الجديدة.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يسمح سير العمل الموازي بإنشاء مكتبات كاملة للمادة المراقبة لتمكين تحديد الهدف الجديد والفحص المتقدم ، إلى جانب مشاريع اكتشاف الأدوية الجزيئية الصغيرة التقليدية.
